2019年5月26日下午，无意中看到hanli0902的关于NGS分析的博文_{https://blog.csdn.net/hanli1992/article/details/82790386}有很多需要学习的地方，在这里贴一些并就不理解之处做些笔记，仅供参考。

NGS基础——NGS分析

NGS 分析步骤

在这里插入图片描述

1. 质量分析

fastqc、multiqc、SolexaQA

测序数据的质量好坏会影响我们的下游分析。但不同的测序平台其测序错误率的图谱都是有差别的。因此，非常建议在我们分析测序数据之前先搞清楚如下两个地方：

原始数据是通过哪种测序平台产生的，它们的错误率分布是怎么样的，是否有一定的偏向性和局限性，是否会显著受GC含量的影响等；评估它们有可能影响哪些方面的分析；

其中fastqc的使用和结果分析在Day1的博文中有简要介绍，另外两个软件的使用方法因为不是今天的重点，若有时间再去查阅相关文章。（在此标记出来，可能在下一篇博文中介绍）

2. 数据过滤

去除接头序列和低质量序列，常用工具：SOAPnuke、cutadapt、untrimmed、fastp、sickle、seqtk、Trimmomatic、Trim Galore（合并了FastQC和cutadapt）同样标记，具体细节查阅后再介绍

3. 比对

使用BWA(exact match)软件把这些短序列和参考基因组进行对比, 确定短序列在基因组上的位置，生成*.sam文件。标记

4. 排序

用samtools等进行比对、排序、建索引，得到reads在参考序列中的位置及质量值，并进行数据格式的转换，得到*.bam文件。标记

5. Bam文件再处理

remove duplicates → indel realign → BQSR
remove duplicates

使用Picard软件（标记）把测序产生的冗余信息和噪声去掉，并对数据质量进行评价。

在制备文库的过程中，由于PCR扩增过程中会存在一些偏差，也就是说有的序列会被过量扩增。这样，在比对的时候，这些过量扩增出来的完全相同的序列就会比对到基因组的相同位置。而这些过量扩增的reads并不是基因组自身固有序列，不能作为变异检测的证据，因此，要尽量去除这些由PCR扩增所形成的duplicates，这一步可以使用picard-tools来完成。去重复的过程是给这些序列设置一个flag以标志它们，方便GATK的识别。还可以设置 REMOVE_DUPLICATES=true来丢弃duplicated序列。对于是否选择标记或者删除，对结果应该没有什么影响，GATK官方流程里面给出的例子是仅做标记不删除。这里定义的重复序列是这样的：如果两条reads具有相同的长度而且比对到了基因组的同一位置，那么就认为这样的reads是由PCR扩增而来，就会被GATK标记。

indel realign

BWA采取exact match策略，在indel附近比对效果不好，需进行局部重新比对。一般来说，绝大部分需要进行重新比对的基因组区域，都是因为插入/缺失的存在，因为在indel附近的比对会出现大量的碱基错配，这些碱基的错配很容易被误认为SNP。还有，在比对过程中，比对算法对于每一条read的处理都是独立的，不可能同时把多条reads与参考基因组比对来排错。因此，即使有一些reads能够正确的比对到indel，但那些恰恰比对到indel开始或者结束位置的read也会有很高的比对错误率，这都是需要重新比对的。Local realignment就是将由indel导致错配的区域进行重新比对，将indel附近的比对错误率降到最低。可以使用GATK工具进行indel重新比对。

BQSR（Base Quality Score Recalibration）

BQSR是对bam文件里reads的碱基质量值进行重新校正，使最后输出的bam文件中reads中碱基的质量值能够更加接近真实的与参考基因组之间错配的概率。例如，在reads碱基质量值被校正之前，我们要保留质量值在Q25以上的碱基，但是实际上质量值在Q25的这些碱基的错误率在1%，也就是说质量值只有Q20，这样就会对后续的变异检测的可信度造成影响。还有，在边合成边测序的测序过程中，在reads末端碱基的错误率往往要比起始部位更高。另外，AC的质量值往往要低于TG。BQSR的就是要对这些质量值进行校正。使用GATK对重新比对的BAM文件做质量校准。

6. 获取突变

用GATK等得到**.vcf**文件，从中获取如外显子区域的数据，错义突变，热点突变，靶向药物相关的突变等感兴趣的突变信息。

7. 注释

使用Annovar对这些变异位点进行功能注释（标记）, 得到一个易于理解的变异位点列表。在这里插入图片描述
下面就一些格式文档进行说明，同样来自hanli0902的博文：https://blog.csdn.net/hanli1992/article/details/82790386

SAM

SAM/BAM格式专用于存储基于参考序列的比对序列，SAM(Sequence Alignment Map)是“序列比对映射”的首字母缩写，是带有比对信息的序列文件（即告诉你这个reads在染色体上的位置等），用于储存序列数据。
经过专门的比对软件，如BWA、BOWTIE2（标记）等，得到的SAM文件如下所示，需要研究的就是如下这几行。
在这里插入图片描述
Coor：坐标的简写，方便查看比对
ref:参考序列
r001/2表示paired end数据，
r003是嵌合read，
r004则是原序列打断后比对结果。
这里没太看懂，有时间再查一下

BAM

BAM是（SAM的）二进制格式,因为它是压缩的、所以数据量更小；因为它是有索引的，所以可以更快地访问它。

VCF(Variant Call Format)

在这里插入图片描述
VCF文件分为两部分内容：以“#”开头的注释部分；没有“#”开头的主体部分。

CHROM和POS：代表参考序列名和variant的位置；如果是INDEL的话，位置是INDEL的第一个碱基位置。

ID：variant的ID。比如在dbSNP中有该SNP的id，则会在此行给出；若没有，则用’.'表示其为一个novel variant。

REF 和 ALT：参考序列的碱基和 Variant的碱基。

QUAL：Phred格式(Phred_scaled)的质量值，表示在该位点存在variant的可能性；该值越高，则variant的可能性越大；计算方法：Phred值 = -10 * log (1-p) p为variant存在的概率; 通过计算公式可以看出值为10的表示错误概率为0.1，该位点为variant的概率为90%。

FILTER：使用上一个QUAL值来进行过滤的话，是不够的。GATK能使用其它的方法来进行过滤，过滤结果中通过则该值为”PASS”;若variant不可靠，则该项不为”PASS”或”.”。

INFO：这一行是variant的详细信息。

FORMAT 和 NA12878：这两行合起来提供了’NA12878′这个sample的基因型的信息。’NA12878′代表这该名称的样品，是由BAM文件中的@RG下的 SM 标签决定的。

GT：样品的基因型（genotype）。两个数字中间用 / 分开，这两个数字表示双倍体的sample的基因型。0 表示样品中有ref的allele； 1 表示样品中variant的allele； 2表示有第二个variant的allele。因此： 0/0 表示sample中该位点为纯合的，和ref一致； 0/1 表示sample中该位点为杂合的，有ref和variant两个基因型； 1/1 表示sample中该位点为纯合的，和variant一致。

AD 和 DP：AD(Allele Depth)为sample中每一种allele的reads覆盖度,在diploid中则是用逗号分割的两个值，前者对应ref基因型，后者对应variant基因型； DP（Depth）为sample中该位点的覆盖度。

GQ：基因型的质量值(Genotype Quality)。Phred格式(Phred_scaled)的质量值，表示在该位点该基因型存在的可能性；该值越高，则Genotype的可能性越大；计算方法：Phred值 = -10 * log (1-p) p为基因型存在的概率。

PL：指定的三种基因型的质量值(provieds the likelihoods of the given genotypes)。这三种指定的基因型为(0/0,0/1,1/1)，这三种基因型的概率总和为1。和之前不一致，该值越大，表明为该种基因型的可能性越小。 Phred值 = -10 * log § p为基因型存在的概率。

身体不适，有点急躁，明天再来