ISME：长期进化实验揭示脱硫弧菌的硝酸盐耐受机制

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摘要

环境中硝酸盐的升高抑制了硫酸盐还原菌（SRB）中重要微生物的硫酸盐还原作用，在硝酸盐含量不断升高的环境中，一些SRB也许会通过硝酸盐呼吸在高氮环境下生存，但是缺少硝酸盐还原酶的SRB如何生存是未知的。为了研究硝酸适应的机制，作者在升高的硝酸钠条件下将12个SRB模式菌株(即Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, DvH)进行平行培养1000代，分析其生长突变型和获得性突变型，并将其基因型与表型联系起来。硝酸盐进化种群（EN population）对于硝酸盐的耐受能力显著增加，宏基因组重测序在12个进化种群的44个基因中鉴定出119个新的突变体。其中在种群水平上（population level）发现了6个高突变频率的功能基因群。

作者在硝酸盐应激反应基因（NSR）、氮调节蛋白C家族基因（NRC)、硝酸群基因中发现了高频率的无义突变和移码突变。突变体分析表明NRC的功能丧失增加了硝酸盐耐受能力。同样，与脂肪酸的合成、离子调节和已知可以响应多种胁迫的两个复合系统（LytR/LytS）的功能基因组群有高频率的错译突变。这些功能基因组群的突变体可以通过调节能量代谢，阻止硝酸盐进入细胞，改变细胞膜的特性或者在生长平稳期赋予生长优势的方式增强氮胁迫能力。这一研究促进了我们对氮耐受机制的理解，并对通过DvH将基因型与形成表型联系起来具有重要意义。

编译：王琳琳

英文标题：Experimental evolution reveals nitrate tolerance mechanisms in Desulfovibrio vulgaris

中文标题：长期进化实验揭示脱硫弧菌的硝酸盐耐受机制

期刊：ISME，2020.09.15

第一作者：Bo Wu

通讯作者：Shouwen Chen,Qingyun Yan,Jizhong Zhou&Zhili He

作者单位：Institute for Environmental Genomics and Department of Microbiology and Plant Biology, University of Oklahoma, Norman, OK, 73019, USA

前言

硫酸盐还原菌(SRB)可以进行异化硫酸盐的还原，在硫、碳、氮、金属的生物地球化学循环中发挥着重要作用，在厌氧环境中如海洋和湖泊沉积地中普遍存在。硝酸盐升高可抑制SRB对有机电子供体的还原作用。DvH（Desulfovibrio vulgaris Hildenborough）缺少功能氮还原酶，他们是如何响应硝酸盐的增加以及如何在长时间的暴露下仍然生长的原因是未知的。

先前的研究表明DvH响应硝酸盐增加的方式有不同途径，而在对高浓度硝酸盐、亚硝酸盐的响应中，很少观察到对其基因表达模式的研究。因此，对于DvH长期暴露于高硝酸盐环境中的硝酸盐耐受能力的遗传基础有待进一步研究。同时，无性繁殖微生物种群的进化实验与全基因组重测序相结合，为识别适应性突变和阐明基因型-表现型关系提供了一个强有力的方法。

材料和方法

菌株、培养条件和繁殖方式

我们从12个AN种群（ancestral populations）中随机选择3个AN种群（AN2， AN8，和AN11）去探索实验中硝酸钠的合适浓度，能够让AN种群在48h内达到一个稳定的状态。AN种群生长在37℃环境下并且在加入10 mM硝酸钠的LS4D培养基上繁殖500代，之后在加入30 mM硝酸钠的LS4D培养基上繁殖500代以维持硝酸DvH群体的硝酸选择压力。每48 h将培养基最终体积的百分之一（100 µL）转移到新鲜培养基中，每次传代达到100次，将菌液保存到-80℃进行进一步的研究，每48 h在转移前测量每一代的OD600。将第6，7 代的生物量的和第1000代的生物量的数据显著性基于方差分析进行计算。

AN种群和EN种群的生长表型

一个培养皿中，一半培养基接种菌悬液，另一半培养基接种原生生物。并设置未接种的对照试验。每个处理5个重复，于黑暗下20℃培养。温育3天后，测量质膜传播距离。

接下来是对AN种群和EN种群基因组DNA的提取以及全基因组重测序和突变体的生成和评估，数据分析以及突变体蛋白结构预测。

缺失突变体及其回复突变体的生长表型研究

硝酸盐应激反应基因的亲代菌株和ME突变体的生长量在LS4D， LS4D + 30 mM NaNO₃ 和 LS4D + 0.15 mM NaNO₂培养基中检测，氮调节蛋白C家族基因的亲代菌株和ME突变体的生长表型在LS4D，LS4D + 30 mM NaNO₃，和 LS4D 100 mM NaCl培养基中检测，另外获得了每个基因的回复突变株 (ME2394、ME2395、ME2396、ME2405、ME2543、ME2547、和ME2548)。进一步对处于生长指数阶段的突变体及其回复突变株进行逆转录PCR，以确保回复突变菌株基因的表达。在LS4D和LS4D+30mmNaNO₃培养基中检测回复突变菌株的生长，采用t检验检测生长参数的统计学显著性。

结果

在正常生长环境条件下，和AN种群比较，EN种群有更短的生长迟滞期和更快的生长速率并且具有更高的硝酸盐耐受能力（图1）

图1 EN种群和AN种群在不断增加的硝酸盐环境中的生长状况

在AN、EN种群中分别发现58个和167个突变体（在每一个AN种群中，突变体的数量大致在8到26之间，在每个EN种群中，突变体的数量大致在13到33之间）。在独立进化的EN种群中观察到相同或相似的突变，表明在群体水平上适应性选择的遗传并行性。在EN种群的44个功能基因中发现了119个新获得突变体（newly acquired mutation），其中，由19个基因组成的6个功能基因组群发生了大规模的变异（84/119），这些基因包括(1) 硝酸盐应激反应基因(NSR: DVU2543、DVU2547和DVU2548)，(2) 硝酸盐调节蛋白C家族基因 (NRC:DVU2394-2396、DVU2402和DVU2405)，(3) 硝酸盐簇（nitrate cluster）(DVU0246-0249 和DVU0251)，(4) 脂肪酸合成基因(DVU1204和DVU1208)，(5) 离子调控基因(DVU0942和DVU2571)，(6) 双复合系统DVU0596和DVU0597（表1）。

表1. 6个基因组19个基因中新获得突变体的数量

以上6个功能基因组群发生无义突变、移码突变和错义突变，可能导致蛋白编码过早终止、截断蛋白（truncated proteins）的产生，或蛋白功能改变，从而影响DvH对硝酸盐升高的响应功能。此外，由于这些突变似乎平行地发生在EN种群中，我们预测这些观察到的突变可能与DvH中硝酸盐耐受能力的增加有关。

在NSR基因群中，与亲代菌株（JZ001）相比，标记基因突变株（ME2543、ME2547和ME2548）具有硝酸盐和亚硝酸盐耐受的能力，它们的回复突变株（ME2548的无法得到）则没有。NSR基因群的无义突变和移码突变可以提高EN种群的硝酸盐耐受性。在NRC基因群中，在100mM NaCl的LS4D培养基中，亲代菌株（JZ001）和四个标记基因突变株生长状况并无明显差别，而在30mMNaNO3的培养基中，除ME2405外，其他标记基因突变株（ME2394、ME2395和ME2396）具有硝酸盐耐受能力。这表明NRC基因群的无义突变和移码突变可能提高EN种群的硝酸盐耐受性(表1，图1）。

在本项研究中，我们在EN种群中发现一系列高突变体，他们对于菌株的硝酸盐耐受能力具有积极影响，这些基因组的天然功能可能与硝酸盐代谢无关，主要是由基因调控。我们预测出了在不断升高的硝酸盐环境下DvH的适应机制，主要包括（1）能量代谢的转移（2）阻止硝酸盐进入细胞（3）改变细胞膜的特性（4）在生长平稳期赋予生长优势(图2)。

图2 在DvH中预测的硝酸盐耐受机制示意图

在实验进化过程中，进化种群中发生的一些有益突变可能只会增加整体的生长(例如：滞后期缩短、生长速率提高、生物量增加)，对特定的胁迫不会产生直接作用。另外，平行进化更有可能通过功能缺失突变发生。因此，在硝酸盐水平升高的情况下，SNP/INDELs的基因平行性及其高的等位基因频率可能是基因群体中重要的有益突变。本研究阐明了硝酸盐种群进化的遗传基础，全面了解了硝态氮耐受机制，对DvH基因型与表型的联系具有重要意义。

参考文献：

1. Zhou JZ, He Q, Hemme CL, Mukhopadhyay A, Hillesland K, Zhou AF, et al. How sulphate-reducing microorganisms cope with stress: lessons from systems biology. Nat Rev Microbiol.
2011;9:452–66.
2. Bowles MW, Mogollon JM, Kasten S, Zabel M, Hinrichs KU. Global rates of marine sulfate reduction and implications for subsea-floor metabolic activities. Science. 2014;344:889–91.
3. Plugge CM, Zhang W, Scholten JC, Stams AJ. Metabolic flexibility of sulfate-reducing bacteria. Front Microbiol. 2011;2:81

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41396-020-00753-5

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