宏基因组测序实验分析方法-功能分析基于reads

1 使用ctab法或相应试剂盒提取样本中的总 DNA；

2 DNA样品检测合格后，使用Covaris超声波破碎仪随机打断，再经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备工作；

3 利用 Illumina NovaSeq 高通量测序平台进行宏基因组测序，获得样品中细菌、真菌和病毒等的宏基因组序列；

4 数据质控和去宿主序列：采用KneadData软件对原始数据进行质控(基于Trimmomatic)和去宿主(基于Bowtie2)，KneadData前和KneadData后，用FastQC来检测质控合理性和效果。

5 物种注释：使用Kraken2和自建的微生物核酸数据库(筛选NCBI NT核酸数据库和RefSeq全基因组数据库中属于细菌，真菌，古菌，病毒的序列)比对来计算样本中所含有物种的序列数，再用Bracken来对样本中物种的实际丰度进行估计。

6 功能数据库注释：从质控以及去除宿主基因的reads出发，使用HUMAnN2软件（基于DIAMOND），将各个样本的reads比对到数据库（UniRef90），根据UniRef90 ID 和各个数据库的对应关系，得到各个功能数据库的注释信息和相对丰度表。

7 基于物种丰度表和功能丰度表，可以进行丰度聚类分析，PCoA和NMDS降维分析（仅物种），样品聚类分析；当有分组信息时，可以进行LEfSe biomarker挖掘分析以及代谢通路比较分析，挖掘样品之间的物种组成和功能组成差异。

8 抗性基因注释：从去除宿主基因的clean reads出发，使用DIAMOND软件将各个样本的质控以及去除宿主基因的reads与抗生素抗性基因数据库CARD进行比对注释，可以获得抗性基因丰度分布情况。

宏基因组测序实验分析方法（功能分析基于组装）

1 使用ctab法或相应试剂盒提取样本中的总 DNA；

2 DNA样品检测合格后，使用Covaris超声波破碎仪随机打断，再经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备工作。

3 利用 Illumina NovaSeq 高通量测序平台进行宏基因组测序，获得样品中细菌、真菌和病毒等的宏基因组序列；

4 数据质控和去宿主序列：采用KneadData软件对原始数据进行质控(基于Trimmomatic)和去宿主(基于Bowtie2)，KneadData前和KneadData后，会用FastQC来检测质控合理性和效果。

5 功能注释：运用MEGAHIT软件，将所有样本去宿主基因后的clean reads进行组装，得到contigs; 运用prodigal软件，预测contigs中的基因序列; 再用Cd-hit软件，对得到的基因进行去冗余，得到去冗余基因; 使用Salmon软件，对去冗余基因进行定量; 使用eggnog-mapper, DIAMOND软件，对去冗余基因进行各个数据库的注释。统计各个数据库的基因相对丰度表。

6 物种注释：用diamond 将非冗余蛋白比对到NCBI NR蛋白数据库，比对结果再用BASTA软件分析得到非冗余蛋白的物种注释信息；同时使用Kraken2和自建的微生物核酸数据库(筛选NCBI NT核酸数据库和RefSeq全基因组数据库中属于细菌，真菌，古菌，病毒的序列)比对来计算样本中所含有物种的序列数，再用Bracken来对样本中物种的实际丰度进行估计。

7 抗性基因注释：运用DIAMOND软件，将去冗余基因比对到CARD数据库，得到CARD数据库的抗性基因注释信息，根据去冗余基因的丰度信息，统计抗性基因的相对丰度表。

8 基于物种丰度表和功能丰度表，可以进行丰度聚类分析，PCoA和NMDS降维分析（仅物种），样品聚类分析；当有分组信息时，可以进行LEfSe biomarker挖掘分析以及代谢通路比较分析，挖掘样品之间的物种组成和功能组成差异。