测序比对软件的总结----hisat2

article/2025/11/5 8:41:41

hisat2的官网的manual：
https://github.com/DaehwanKimLab/hisat2/blob/master/MANUAL
在这里记载了详细用法和介绍，此处仅为学习笔记，和实例记录。

HISAT2 is a fast and sensitive alignment program for mapping next-generation sequencing reads (whole-genome, transcriptome, and exome sequencing data) against the general human population (as well as against a single reference genome). Based on [GCSA] (an extension of [BWT] for a graph), we designed and implemented a graph FM index (GFM),
an original approach and its first implementation to the best of our knowledge. 
In addition to using one global GFM index that represents general population, 
HISAT2 uses a large set of small GFM indexes that collectively cover the whole genome 
(each index representing a genomic region of 56 Kbp, with 55,000 indexes needed to cover human population). 
These small indexes (called local indexes) combined with several alignment strategies enable effective alignment of sequencing reads. 
This new indexing scheme is called Hierarchical Graph FM index (HGFM). 
We have developed HISAT 2 based on the [HISAT] and [Bowtie2] implementations.
HISAT2 outputs alignments in [SAM] format, enabling interoperation with a large number of other tools (e.g. [SAMtools], [GATK]) that use SAM.
HISAT2 is distributed under the [GPLv3 license], and it runs on the command line under
Linux, Mac OS X and Windows.
  • 适用范围

RNA-SEQ

  • 使用方法
    1.下载数据
    在hisat官网下载UCSC的数据：http://daehwankimlab.github.io/hisat2/download/
    在这里插入图片描述
wget -c -t 0 https://genome-idx.s3.amazonaws.com/hisat/mm10_genome.tar.gz

解压缩

tar -zxvf mm10_genome.tar.gz

2.建立索引

hisat2-build [options]* <reference_in> <ht2_base>
$HISAT2_HOME/hisat2-build $HISAT2_HOME/example/reference/22_20-21M.fa --snp $HISAT2_HOME/example/reference/22_20-21M.snp 22_20-21M_snp
#<reference_in> ：fasta文件 list，如果为list，使用逗号分开
#<ht2_base> ：索引文件的前缀名，如设为xxx，则生成的索引文件为xxx.1.ht2,xxx.2.ht2，默认的前缀名为NAME

snp文件可以从官网下载

Use `hisat2_extract_snps_haplotypes_UCSC.py` (in the HISAT2 package) to extract SNPs and haplotypes from a dbSNP file (e.g. http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/database/snp144Common.txt.gz).
or `hisat2_extract_snps_haplotypes_VCF.py` to extract SNPs and haplotypes from a VCF file (e.g. ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp/release/20130502/supporting/GRCh38_positions/ALL.chr22.phase3_shapeit2_mvncall_integrated_v3plus_nounphased.rsID.genotypes.GRCh38_dbSNP_no_SVs.vcf.gz).

实例：
（1）生成snp，先-h看看里面有啥要求

(riboseq) [med-zhouh@login01 hisat2]$ hisat2_extract_snps_haplotypes_UCSC.py -h
usage: hisat2_extract_snps_haplotypes_UCSC.py [-h] [--inter-gap INTER_GAP] [--intra-gap INTRA_GAP] [-v] [--testset][genome_file] [snp_fname] [base_fname]Extract SNPs and haplotypes from a SNP file downloaded from UCSC (e.g. http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/database/snp144.txt.gz)positional arguments:genome_file           input genome file (e.g. genome.fa)snp_fname             input snp file downloaded from UCSC (plain text or gzipped file is accepted: snp144Common.txt or snp144Common.txt.gz)base_fname            base filename for SNPs and haplotypesoptional arguments:-h, --help            show this help message and exit--inter-gap INTER_GAPMaximum distance for variants to be in the same haplotype--intra-gap INTRA_GAPBreak a haplotype into several haplotypes-v, --verbose         also print some statistics to stderr--testset             print test reads

看完要求就写一下，生成snp

从genecode里面下载的fasta文件。

hisat2_extract_snps_haplotypes_UCSC.py /data/med-zhouh/index/bowtie2_human_h38_index/GRCh38.p13.genome.fa snp144Common.txt h38_snp

得到结果如下：

-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh 594M Jul 28 12:33 h38_snp.haplotype
-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh 482M Jul 28 12:33 h38_snp.snp
-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh 4.8G Jan 13  2016 snp144Common.txt

(2)用刚生成的snp，和来自genecode的fa,生成索引

hisat2-build /data/med-zhouh/index/bowtie2_human_h38_index/GRCh38.p13.genome.fa --snp h38_snp hisat2_hg38_p13

得到文件如下：

-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh 992M Jul 28 14:57 hisat2_hg38_p13.1.ht2
-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh 741M Jul 28 14:57 hisat2_hg38_p13.2.ht2
-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh  17K Jul 28 14:14 hisat2_hg38_p13.3.ht2
-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh 741M Jul 28 14:14 hisat2_hg38_p13.4.ht2
-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh 1.3G Jul 28 15:05 hisat2_hg38_p13.5.ht2
-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh 754M Jul 28 15:05 hisat2_hg38_p13.6.ht2
-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh   12 Jul 28 14:14 hisat2_hg38_p13.7.ht2
-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh    8 Jul 28 14:14 hisat2_hg38_p13.8.ht2
-rw-r--r-- 1 med-zhouh med-chenh  41G Jul 28 13:16 hisat2_hg38_p13.rf

2.比对
官网实例：

hisat2 [options]* -x <hisat2-idx> {-1 <m1> -2 <m2> | -U <r> | --sra-acc <SRA accession number>} [-S <hit>]$HISAT2_HOME/hisat2 -f -x $HISAT2_HOME/example/index/22_20-21M_snp -U $HISAT2_HOME/example/reads/reads_1.fa -S eg1.sam#-p ：线程数目
#--dta  ：注意！！！在下游使用stringtie组装的时候一定要在hisat中设置这个参数！！！
#-x <hisat2-idx> ：参考基因组索引的basename，即前缀名
#{}：其中的内容意思为hisat2可以接受单端测序，双端测序，或者直接提交SRA ID号
#-1 <m1> ：双端测序的read1 list ，若为list，使用逗号隔开，名字与2要匹配，如-1 flyA_1.fq,flyB_1.fq
#-2 <m2> ：双端测序的read2 list ，若为list，使用逗号隔开，名字与1要匹配，如-2 flyA_2.fq,flyB_2.fq
#-U <r>：单端测序list，若为list，使用逗号隔开，-U lane1.fq,lane2.fq,lane3.fq,lane4.fq
#--sra-acc <SRA accession number> : SRAID list，若为list，使用逗号隔开，--sra-acc SRR353653,SRR353654
#-S <hit> ：SAM写入的文件名，默认写入到标准输出中

单末端

##官网例子 ：$HISAT2_HOME/hisat2 -f -x $HISAT2_HOME/example/index/22_20-21M_snp -U $HISAT2_HOME/example/reads/reads_1.fa -S eg1.sam
hisat2 -f -x /xx/mm10/genome -U/xx/SRR12207279_trimmed.fq  -S /xx/xx/SRR12207279.sam

双末端

##官网例子：$HISAT2_HOME/hisat2 -f -x $HISAT2_HOME/example/index/22_20-21M_snp -1 $HISAT2_HOME/example/reads/reads_1.fa -2 $HISAT2_HOME/example/reads/reads_2.fa -S eg2.sam
hisat2 -f -x /xx/mm10/genome -1 /xx/SRR12207279_1_trimmed.fq -2 /xx/xx/SRR12207279_2_trimmed.fq -S /xx/xx/SRR12207279.sam

得到一个sam文件，结果如下：

@HD     VN:1.0  SO:unsorted@SQ     SN:22:20000001-21000000 LN:1000000@PG     ID:hisat2       PN:hisat2       VN:2.0.0-beta1       0       22:20000001-21000000    397984  255     100M    *       0       0       GCCTGTGAGGGAGCCCCGGACCCGGTCAGAGCAGGAGCCTGGCCTGGGGCCAAGTTCACCTTATGGACTCTCTTCCCTGCCCTTCCAGGAGCAGCTCACT    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU NH:i:12       16      22:20000001-21000000    398131  255     100M    *       0       0       ATGACACACTGTACACACCAGGGGCCCTGTGCTCCCCAGGAAGAGGGCCCTCACTTGAAGCGGGGCCCGATGGCCGCCACGTGCCGGTTCATGCTCCCCT    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:80A19      YT:Z:UU NH:i:1  Zs:Z:80|S|rs5761598953       16      22:20000001-21000000    398222  255     100M    *       0       0       TGCTCCCCTTGGCCCCGCCGATGTTCAGGGACATGGAGCGCTGCAGCAGGCTGGAGAAGATCTCCACTTGGTCAGAGCTGCAGTACTTGGCGATCTCAAA    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:16A83      YT:Z:UU NH:i:1  Zs:Z:16|S|rs26293644       16      22:20000001-21000000    398247  255     90M200N10M      *       0       0       CAGGGACATGGAGCGCTGCAGCAGGCTGGAGAAGATCTCCACTTGGTCAGAGCTGCAGTACTTGGCGATCTCAAACCGCTGCACCAGGAAGTCGATCCAG    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU XS:A:-  NH:i:15       16      22:20000001-21000000    398194  255     100M    *       0       0       GGCCCGATGGCCGCCACGTGCCGGTTCATGCTCCCCTTGGCCCCGCCGATGTTCAGGGACATGGAGCGCTGCAGCAGGCTGGAGAAGATCTCCACTTGGT    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:17A26A55   YT:Z:UU NH:i:1  Zs:Z:17|S|rs576159895,26|S|rs26293646       0       22:20000001-21000000    398069  255     100M    *       0       0       CAGGAGCAGCTCACTGAAATGTGTTCCCCGTCTACAGAAGTACCGTGATACACAGACGCCCCATGACACACTGTACACACCAGGGGCCCTGTGCTCCCCA    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU NH:i:17       0       22:20000001-21000000    397896  255     100M    *       0       0       GTGGAGTAGATCTTCTCGCGAAGCACATTGCAGATGGTTGCATTTGGAACCACATCGGCATGCAGGAGGGACAGCCCCAGGGTCAGCAGCCTGTGAGGGA    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:31G68      YT:Z:UU NH:i:1  Zs:Z:31|S|rs5626622618       0       22:20000001-21000000    398150  255     100M    *       0       0       AGGGGCCCTGTGCTCCCCAGGAAGAGGGCCCTCACTTGAAGCGGGGCCCGATGGCCGCCACGTGCCGGTTCATGCTCCCCTTGGCCCCGCCGATGTTCAG    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:61A26A11   YT:Z:UU NH:i:1  Zs:Z:61|S|rs576159895,26|S|rs26293649       16      22:20000001-21000000    398329  255     8M200N92M       *       0       0       ACCAGGAAGTCGATCCAGATGTAGTGGGGGGTCACTTCGGGGGGACAGGGTTTGGGTTGACTTGCTTCCGAGGCAGCCAGGGGGTCTGCTTCCTTTATCT    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU XS:A:-  NH:i:110      16      22:20000001-21000000    398184  255     100M    *       0       0       CTTGAAGCGGGGCCCGATGGCCGCCACGTGCCGGTTCATGCTCCCCTTGGCCCCGCCGATGTTCAGGGACATGGAGCGCTGCAGCAGGCTGGAGAAGATC    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:27A26A45   YT:Z:UU NH:i:1  Zs:Z:27|S|rs576159895,26|S|rs2629364

sam文件转化成bam,然后排序，生成索引

samtools view -S ${i}.sam -b > ${i}.bam
####bam文件排序成sort.bam##
samtools sort ${i}.bam -n -o ${i}_sorted.bam
###Sort.bam建立index文件##samtools index ${i}_sorted.bam
####sort.bam进行比对得到bai和stat##

进行排序之后结果如下：

@HD     VN:1.0  SO:coordinate
@SQ     SN:chr1 LN:248956422
@SQ     SN:chr2 LN:242193529
@SQ     SN:chr3 LN:198295559
@SQ     SN:chr4 LN:190214555
@SQ     SN:chr5 LN:181538259
@SQ     SN:chr6 LN:170805979
@SQ     SN:chr7 LN:159345973
@SQ     SN:chr8 LN:145138636
@SQ     SN:chr9 LN:138394717

查看比对成功率

(base) [med-zhouh@login01 riboseq]$ cat *stat | grep %
76497603 + 0 mapped (91.97% : N/A)
91704826 + 0 mapped (93.17% : N/A)
72387422 + 0 mapped (91.84% : N/A)
88842249 + 0 mapped (91.83% : N/A)

去除重复再次比对

samtools markdup -r ${i}_sorted.bam ${i}.rmdup.bam
###再重复一个index##
samtools index ${i}.rmdup.bam
###继续比对一下##
samtools flagstat ${i}.rmdup.bam > ${i}.rmdup.stat

得到结果如下：

(riboseq) [med-zhouh@login01 riboseq]$ cat *.rmdup.stat | grep %
50411129 + 0 mapped (88.30% : N/A)
60915889 + 0 mapped (90.06% : N/A)
49874257 + 0 mapped (88.57% : N/A)

完成！


http://chatgpt.dhexx.cn/article/TE5WUOut.shtml

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1.数据(Data)&#xff1a;数据就是用户输入到计算机被计算机程序处理的一些符号&#xff0c;比如图片还有声音等.... 2.数据元素(Data Element)&#xff1a;是数据的基本单位&#xff0c;数据元素用于完整的描述一个对象&#xff0c;比如一个学生表&#xff0c;学生表也是由 数…
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element el-transfer穿梭框的使用，自定义穿梭框的数据项

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本文概述基本穿梭框效果自定义数据项实现右侧列表元素变化时触发方法 本文概述 查看element官方文档可以了解到 el-transfer穿梭框的基本使用方法&#xff0c;本文主要介绍数据项的自定义渲染和右侧列表元素变化时触发方法的实现。 自定义数据项&#xff0c;除了基本的el-tra…
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