系列文章：
二代测序方法：DNA测序之靶向重测序
NGS数据分析实践：00. 变异识别的基本流程
NGS数据分析实践：01. Conda环境配置及软件安装
NGS数据分析实践：02. 参考基因组及注释库的下载
NGS数据分析实践：03. 涉及的常用数据格式[1] - fasta和fastq格式
NGS数据分析实践：03. 涉及的常用数据格式[2] - sam/bam格式
NGS数据分析实践：03. 涉及的常用数据格式[3] - gtf/gff格式
NGS数据分析实践：03. 涉及的常用数据格式[4] - bed和Wiggle/Bigwig/bedgraph格式

测序数据分析中涉及的常用格式：测序得到的是带有质量值的碱基序列(fastq格式)，参考基因组是(fasta格式)，用比对工具把fastq格式的序列比对到对应的fasta格式的参考基因序列，就可以产生sam格式的比对文件。把sam格式的文本文件压缩成二进制bam文件可以节省空间，如果对参考基因组上面的各个区段标记它们的性质，比如哪些区域是外显子、内含子、UTR等等，这就是gtf/gff格式。如果只是为了单纯描述某个基因组区域，就是bed格式文件，记录染色体号以及起始终止坐标，正负链即可。如果是记录某些位点或者区域碱基的变异，就是vcf文件格式。

fasta/fastq(测序数据)→SAM/BAM(比对)→gff/gtf(描述基因组上的结构：坐标&类型)→Bigwig/Wiggle(测序深度)→bed(描述坐标)→vcf(突变信息)

存储序列：fasta/fastq
比对结果显示的文件：sam/bam
展示注释信息：gtf/gff/bed
突变信息：vcf

6. vcf格式

VCF格式全称为 Variant Call Format，是存储变异位点的标准格式，可以用来表示单核苷酸多态性（SNP）【在人类基因组中，分布普遍并且密度比较大，总数超过10⁷， 平均每300bp就有一个SNP 】、插入缺失（InDel，也就是短片段的插入与缺失）、结构变异(SV：Structural Variant，也就是大片段的插入与缺失) 、拷贝数量变异（CNV：Copy Number Variant）【CNV：比如一个基因在染色体的一条染色单体上的数目为1，但是在染色体复制过程中，不知为何，复制结束后该基因在染色单体数目由1变成了2或者n。尤其在人类基因组中存在大量大于1 kb但小于3 Mb的DNA片段多态。它发生的频率远远高于染色体结构变异，并且整个基因组中覆盖的核苷酸总数大大超过SNP的总数】。VCF格式在GATK软件中得到很好的支持。
官方说明详见：http://gatkforums.broadinstitute.org/discussion/1268/how-should-i-interpret-vcf-files-produced-by-the-gatk

6.1 vcf格式整体描述

VCF文件分为两部分内容：以“##”开头的meta信息部分（key=value）和主体数据部分；可理解为注释部分 + 主体部分。
注释部分有很多对VCF的介绍信息；主体部分每一行代表一个variant的信息。单样本的vcf文件一般含10列数据：CHROM、POS、ID、REF、ALT、QUAL、FILTER、INFO、FORAMT、SAMPLE。其中，前8列为固定的必须要有的列，各列以制表符(\t)分割。

以下为每一列的说明：

注意：FORMAT & SAMPLE：两部分共同描述了变异位点的基本统计信息，不同信息之间由“：”分隔。每一个sample对应着1列；多个samples则对应着多列，这种情况下，列的数多余10列，且个sample列的ID不能重复。各标签代表的意义在注释部分##FORMAT有详细说明。

例如：FORMAT为GT:AD:DP:GQ:PL，SAMPLE为0/1:16,11:27:99:251,0,375，表示该样本的该变异位点GT（Genotype）为0/1，AD（Allele Depth）为16,11，DP（Read Depth）为27，GQ（Genotype Quality）为99，PL（provides the likelihoods of the given genotypes）为251,0,375。

注：不同的变异识别软件生成的vcf文件中，INFO和FORAMT两列的tags可能略有不同，含义可参照注释部分，或者软件使用说明。

6.2 第8列INFO详解

第8列(INFO)的信息包括18种，都是以“TAG=Value”，并使用分号分隔的形式，其中很多的注释信息在VCF文件的头部注释中给出，下面对常用的TAG进行解释：

和等位基因有关的3个TAGs：
AN（Allele Number）： alleles的总数目。
AC（Allele Count）： 基因型为variant allele的数目。
AF（Allele Frequency）： variant allele的频率，AF值=AC值/AN值。
例子1：对2个sample的二倍体进行测序，则AN值为4。若REF上位点碱基为A，2个sample在该位点分别为A/T和T/G；则AC=1；AF=0.25（在该位点只有25%的等位基因发生突变）。
例子2：对1个sample的二倍体测序，则AN=2。若基因型为杂合突变0/1，则该位点只有一个等位基因发生突变，AC=1，AF=0.5；若基因型为纯合突变1/1，AC=2，AF=1。

DP（reads覆盖度）：一部分reads被过滤掉后的覆盖度。

DP4 ： 高质量测序碱基，包含4个值：ref-forward , ref-reverse, alt-forward, alt-reverse。

Dels：Fraction of reads containing spanning delections，这个值用来区分indel和snv，有这个tag且为0时表示该位点是SNV，没有就是InDel。【一个物种中该单碱基变异的频率达到一定水平就叫SNP，而频率很低或未知就叫SNV】

FS：FisherStrand的缩写，表示使用Fisher’s精确检验来检测strand bias而得到的Fhred格式的p值，该值越小越好；如果该值较大，表示strand bias（正负链偏移）越严重，即所检测到的variants位点上，reads比对到正负义链上的比例不均衡。一般进行filter的时候，推荐保留FS<10~20的variants位点。GATK可设定FS参数。

ReadPosRandSum：Z-score from Wilcoxon rank sum test of Alt vs. Ref read position bias.当variants出现在reads尾部的时候，其结果可能不准确。该值用于衡量alternative allele（变异的等位基因）相比于reference allele（参考基因组等位基因），其variant位点是否匹配到reads更靠中部的位置。因此只有基因型是杂合且有一个allele和参考基因组一致的时候，才能计算该值。若该值为正值，表明和alternative allele相当于reference allele，落来reads更靠中部的位置；若该值是负值，则表示alternative allele相比于reference allele落在reads更靠尾部的位置。 进行filter的之后，推荐保留ReadPosRankSum>-1.65~-3.0的variant位点

MQRankSum： 该值用于衡量alternative allele上reads的mapping quality与reference allele上reads的mapping quality的差异。若该值是负数值，则表明alternative allele比reference allele的reads mapping quality差。进行filter的时候，推荐保留MQRankSum>-1.65~-3.0的variant位点。

6.3 第9列FORMAT详解

VCF文件主体部分的第9列是基因型信息的多个标签，这些标签之间以冒号分割，其对应的值位于第10列，同样以冒号分割，表示第一个样本的基因型结果。若有多个样本，则VCF文件超过10列，且第10列后的每一列表示一个样品的基因型结果。各标签的具体含义，需参照该文件的标头注释。

第9列(FORMAT) 各个标签的意义展示如下：
GT：genotype
样本（sample）的基因型（genotype），两个数字中间用‘/’分开，这两个数字表示双倍体的sample的基因型。0表示样品中有reference的allele（可初步理解为和ref的碱基相同，即和REF列相同）；1表示样本中的variant的allele（可以理解为和variant变异后的碱基相同，即和ALT列相同）；2表示有第二个variant的allele（和ALT列的第二种碱基相同）对于SNP是指单个碱基类型相同而对于Indel是指碱基类型及个数均相同。
因此，根据GT的结果得出以下结论：
0/0表示sample中该位点为纯合位点，和REF的碱基类型一致；
0/1表示sample中该位点为杂合突变，有REF和ALT两个基因型（部分碱基和REF碱基类型一致，部分碱基和ALT碱基类型一致）；
1/1表示sample中该位点为纯合突变，总体突变类型和ALT碱基类型一致；
1/2表示sample中该位点为杂合突变，有ALT1和ALT2两个基因型（部分和ALT1碱基类型一致，部分和ALT2碱基类型一致）。

AD和DP
AD(Allele Depth) 为sample中每一种allele（等位碱基）的reads覆盖度，在diploid（二倍体，或可指代多倍型）中则是用逗号分隔的两个值，前者对应REF基因，后者对应ALT基因型；
DP(Depth) 为sample中该位点的覆盖度，是所支持的两个AD值（逗号前和逗号后）的加和。【第8列也有DP，但含义不同】
例如：
GT:AD(REF),AD(ALT):DP
1/1:0,175:175
0/1:79,96:175
1/2:0,20,56:76
这里的三种类型对应的DP值均是其对应的AD值的加和，1/1的175是0+175，0/1的175是79+96，1/2的76是0+20+56。

GQ（Genotype Quality）
基因型的质量值。Phred格式（Phred_scaled）的质量值，表示在该位点该基因型存在的可能性；该值越高，则Genotype的可能性越大；计算方法：Phred值=-10*log(1-P)，P为基因型存在的概率。（一般在final.snp.vcf文件中，该值为99，为99时，其可能性最大）。

PL（likelihood genotypes）
指定的三种基因型的质量值（provieds the likelihoods of the given genotypes）；这三种指定的基因型为（0/0，0/1，1/1），这三种基因型的概率总和为1。该值越大，表明为该种基因型的可能性越小。Phred值=-10*log§，P为基因型存在的概率。最有可能的genotype的值为0。
例如：
0/0:0,889,216 （0/0型3个数字，第一个为0）；
0/1:94,0,940 （0/1型3个数字，中间为0）；
1/1:269,18,0 （1/1型3个数字，最后一个为0）；
1/2:3365,1522,1357,1842,0,1706 （0/0,0/1,1/1,0/2,1/2,2/2 ?）（1/2型6个数字，倒数第二个为0）。

更多信息见官方说明文档：https://samtools.github.io/hts-specs/VCFv4.2.pdf

6.4 vcf文件简单解读

用VCFv4.2官方文件中的例子，做一个简单的展示：

① 主体部分第1行：一个高质量的简单SNP，碱基质量值为29；
② 主体部分第2行：一个可能会被过滤掉的SNP，因为质量值<10；
③ 主体部分第3行：第4列REF等位为A，call出了两个alternate alleles，其中一个为T。INFO列中显示AA=T，表明T是祖先等位，因此，该变异可能是参考测序错误；
④ 主体部分第4行：该位点是单态性SNP，没有其他等位。
⑤ 主体部分第5行：包含两个alternate alleles的微卫星，即2个碱基的删除(TC)和1个碱基的插入(T)。
示例中包含3个样本，FORMAT未TAG，sample列为相应的取值value，包括：基因型(GT)、每个样本的碱基质量(GQ)、深度(DP)和单体型质量(HQ)等。

其他SNP和INDELs的示例：

参考阅读：
http://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat.html
VCF格式：https://www.jianshu.com/p/957efb50108f
生信宝典 生信分析过程中这些常见文件的格式以及查看方式你都知道吗？
常用生物信息学格式介绍：http://ju.outofmemory.cn/entry/193943
https://samtools.github.io/hts-specs/VCFv4.2.pdf
https://samtools.github.io/hts-specs/VCFv4.3.pdf