NCBI的NT库比对——blastn
NT库比对，包括对测序数据和组装后的基因组序列进行NT库比对，查看是否存在菌污染以及是否是自己的数据。这里我提供这一部分的具体操作过程。
步骤一：NT全库下载
前面有一篇博文，提到了通过Aspera软件下载nt/nr/swissprot库。但是最近发现Aspera会报错，所以wget下载会好很多。（如果你的Aspera下载流畅，都可以）
时间：2022-09-26
NT库：https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/
有75个子文件：https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/nt.XX.tar.gz，且这75个文件是构建好的文件（使用了makeblastdb命令）。因此解压后，不需要使用makeblastdb命令
有1个总文件：https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FASTA/nt.gz，这仅是fasta文件。因此解压后，需要使用makeblastdb命令
这里我对75个子文件下载。
cd /home/zhaohuiyao/Database/NT
#使用Aspera下载（尝试）
/home/zhaohuiyao/.aspera/connect/bin/ascp -v -QT -l 400m -k1 –i /home/zhaohuiyao/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh anonftp@ftp.ncbi.nlm.nih.gov:/blast/db/nt.00.tar.gz ./
#报错信息，可能是服务器或者网络受限的问题
ascp: no remote host specified
Startup failed, exit
#使用wget下载，速度3MB/s（尝试）
wget https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/nt.00.tar.gzmkdir /home/zhaohuiyao/Database/NT/nt #存放解压后的文件
#共00~74个nt文件，编辑download_nt.sh，全部下载
#!/bin/bash
echo "download nt start on `date`"
cd /home/zhaohuiyao/Database/NT/
for i in {00..74}
dowget https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/nt.${i}.tar.gz ./wget https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/nt.${i}.tar.gz.md5 ./md5sum -c ./nt.${i}.tar.gz.md5tar -zxvf ./nt.${i}.tar.gz -C ./nt/echo "nt.${i} has done."
done
echo "download nt end on `date`"nohup /bin/bash ./download_nt.sh &
#查看目录/home/zhaohuiyao/Database/NT/nt下内容，下载完成
#查看文件nohup.out，查看是否所有都完成。grep "has done" ./nohup.out
nt.00 has done.
nt.01 has done.
nt.02 has done.
...
nt.74 has done.#若觉得占空间，可以将下载nt.XX.tar.gz和nt.XX.tar.gz.md5进行删除
rm nt.XX.tar.gz
rm nt.XX.tar.gz.md5
完成以上过程，你就拿到了构建好的NT全库了，接下来，就可以进行比对。
步骤二：随机提取10000条或5000条序列
如果是组装好的基因组文件，那么你可以根据情况选择（例如总共1000条，那就随机提取100条即可）
cd /home/zhaohuiyao/Genome_survey/nt
#这是常见的二代双端数据，两个fastq文件。每一个文件随机提取5000条。
nohup python3 Extract_sequence.py -i /XXX/raw_data/XXX_L1_1.fq -I /XXX/raw_data/XXX_L1_2.fq -o ./ -out_name XXX -f fq -n 10000 &
#最后拿到结果文件XXX_10000.fa
#参数-i：文件1；参数-I：文件2；参数-o：输出目录；参数-out_name：输出文件名；参数-f：fq/fa。默认是fq；参数-n：提取的序列个数#如果你是PacBio的HiFi测序数据，公司会给你bam/fasta/fastq格式的数据文件。这里仅针对fastq/fasta文件，提取5000条序列
nohup python3 Extract_sequence.py -i /XXX/raw_data/XXX_L1_1.fq -o ./ -out_name XXX -f f -n 5000 &
步骤三：对提取10000条序列进行全NT库blastn比对
保证软件blast已安装成功且测试通过
#全NT库已经是构建好的，直接进行blast
cd /home/zhaohuiyao/Genome_survey/nt/
nohup blastn -num_threads 32 -max_target_seqs 10 -evalue 1e-05 -db /home/zhaohuiyao/Database/NT/nt/nt -outfmt "7 qseqid sseqid evalue pident ppos length mismatch gapopen qstart qend sstart send bitscore staxid sscinames stitle" -query ./XXX_10000.fa -out ./XXX_10000.blastn.out &#具体的参数含义，自行查阅即可
#可能会遇到这样的报错：BLAST Database error: Error: Not a valid version 4 database。原因可能是blast版本低，使用高版本的blast
#报警告，不影响blast结果，只是因为没有物种信息，无法用staxid获取sscinames信息
Warning: [blastn] Taxonomy name lookup from taxid requires installation of taxdb database with ftp://ftp.ncbi.nlm .nih.gov/blast/db/taxdb.tar.gz
#更新命令
cd /home/zhaohuiyao/Database/NT/
wget http://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/taxdb.tar.gz
tar -zxvf ./taxdb.tar.gz -C ./nt/
#更新后没有用，因此这里我整理一下staxid、scinames的信息，最后补充到blast结果中。如果你没有这类问题，则忽略
#我的blast结果（缺失scinames的信息，显示为N/A）
# BLASTN 2.10.1+
# Query: A00808:1021:H5HHFDSX3:3:2478:32217:24627 1:N:0:GACCAAGCTT+AGTGGAGTCA
# Database: /home/zhaohuiyao/Database/NT/nt/nt
# Fields: query id, subject id, evalue, % identity, % positives, alignment length, mismatches, gap opens, q. start, q. end, s. start, s. end, bit score, subject tax id, subject sci name, subject title
# 46 hits found
A00808:1021:H5HHFDSX3:3:2478:32217:24627 gi|2268683873|emb|OX155639.1| 2.56e-54 93.421 93.42 152 8 2 1 150 15472611 15472762 224 218720 N/A Carterocephalus palaemon genome assembly, chromosome: 2
补充：staxid的scinames关系信息
这一步只有你的blastn的结果中scinames这一栏是N/A的情况下进行，若是没有，则跳过
#下载最新的taxdmp.zip（2022-09-28）
mkdir -p /home/zhaohuiyao/Database/taxdmp/ && cd /home/zhaohuiyao/Database/taxdmp/
wget https://ftp.ncbi.nih.gov/pub/taxonomy/taxdmp.zip
wget https://ftp.ncbi.nih.gov/pub/taxonomy/taxdmp.zip.md5
md5sum -c ./taxdmp.zip.md5
unzip ./taxdmp.zip
#解压后的文件中names.dmp，是我们需要的staxid-scinames关系文件
#执行脚本staxid-scinames.py，拿到两者关系文件staxid-scinames.txt，第一列：staxid；第二列：scinames
python3 ./staxid-scinames.py -i ./names.dmp -o ./#staxid的scinames关系文件目录
/home/zhaohuiyao/Database/taxdmp/staxid-scinames.txt
步骤四：对blastn结果进行统计
这一步执行的前提的是你已经拿到了blastn的结果文件。因为我的脚本里面需要补充scinames信息，所以要提供staxid-scinames.txt文件，若你不需要，则需要将脚本略微修改。（两种我都会提供）
#对blast结果补充scinames信息，并进行总结分类
python3 blastn_stat.py -i ./XXX_10000.blastn.out -f /home/zhaohuiyao/Database/taxdmp/staxid-scinames.txt -o ./XXX_10000.blastn.out.stat -num 10000#结果文件如下，cat XXX_10000.blastn.out.stat
Species_name mapping_reads total_reads ratio
unknown 9265 10000 92.65%
Wolbachia pipientis 207 10000 2.07%
Wolbachia endosymbiont of Ostrinia scapulalis 99 10000 0.99%
Wolbachia endosymbiont of Chrysomya megacephala 92 10000 0.92%
Opisthograptis luteolata 91 10000 0.91%
Wolbachia endosymbiont of Ostrinia furnacalis 90 10000 0.90%
Wolbachia endosymbiont of Corcyra cephalonica 76 10000 0.76%
Wolbachia pipientis wAlbB 76 10000 0.76%
Wolbachia endosymbiont of Drosophila mauritiana 75 10000 0.75%
Wolbachia endosymbiont of Diaphorina citri 73 10000 0.73%
#取blast前10的物种输出。第一列：物种名；第二列：比对到该物种的reads数；第三列：总参与比对reads数；第四列：占比
#为什么unknown这么多，这是二代数据太短了，150bp，造成的#这是一个PacBio的Hifi测序数据的NT库比对结果
Species_name mapping_reads total_reads ratio
unknown 1506 5000 30.12%
Glyphotaelius pellucidus 204 5000 4.08%
Spodoptera littoralis 195 5000 3.90%
Zeuzera pyrina 183 5000 3.66%
Hypsopygia costalis 171 5000 3.42%
Calamotropha paludella 169 5000 3.38%
Cerceris rybyensis 168 5000 3.36%
Mellicta athalia 166 5000 3.32%
Phosphuga atrata 155 5000 3.10%
Schistocerca gregaria 150 5000 3.00%总结
因为考虑到全库比对会比较费时间，所以计划构建子库。但是尝试后发现，全库比对的时间可以接受，所以放弃制作子库，但是可以作为拓展练习。（正在努力，完成后会和大家分享学习~~ 这里提供别人的一篇文章，供大家参考，这是一篇nr子库构建：https://cloud.tencent.com/developer/article/1943973）
还有上面提到的四个脚本，我放在了gitee上，大家可以下载学习，也可以自己写。https://gitee.com/zhao-huiyao/python_script/tree/master/NT%E5%BA%93%E6%AF%94%E5%AF%B9
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