第四代测序技术（纳米孔测序技术）

纳米孔测序技术（又称第四代测序技术）是最近几年兴起的新一代测序技术。目前测序长度可以达到150kb。这项技术开始于90年代，经历了三个主要的技术革新：一、单分子DNA从纳米孔通过；二、纳米孔上的酶对于测序分子在单核苷酸精度的控制；三、单核苷酸的测序精度控制。

第四代测序技术是真正实现单分子检测和电子传导检测相结合的测序方法，完全摆脱了洗脱过程、PCR扩增过程。作为最有希望实现1000美元基因组甚至100美元基因组的技术，纳米孔技术具有超高读长、高通量、更少的测序时间和更为简单的数据分析，实现了从低读长到超高读长、从光学检测到电子传导检测的双重跨越。一旦第四代测序技术投入市场，将有望在几小时内以几百美元的成本完成全基因组测序。也正因此，众多基因测序公司和投资人都把目光聚焦在了第四代测序领域。目前市场上广泛接受的纳米孔测序平台是Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的MinION纳米孔测序仪。它的特点是单分子测序，测序读长长（超过150kb），测序速度快，测序数据实时监控，机器方便携带等。这篇综述重点总结了MinION测序仪的技术特点和应用领域。

一、 MinION测序技术简介

MinION纳米孔测序仪的核心是一个有2,048个纳米孔，分成512组，由专用集成电路控制的flow cell。测序原理见图1a所示：首先，将双分子DNA连接lead adaptor（蓝色），hairpin adaptor（红色）和trailing adaptor（棕色）；当测序开始，lead adaptor带领测序分子进入由酶控制的纳米孔，lead adaptor后是template read（即待测序的DNA分子）通过纳米孔，hairpin adaptor的作用是DNA双链测序的保证，然后complement read（待测序分子的互补链）通过纳米孔，最后是trailing adaptor通过。在上述测序方法中，template read和complement read依次通过纳米孔，利用pairwise alignment，它们组合成2D read；而在另外一种测序方法中，不使用hairpin adaptor，只测序template read，最终形成1D read。后一种测序方法通量更高，但是测序准确性低于2D read。每个接头序列（adaptor）通过纳米孔引起的电流变化不同（图1c），这种差别可以用来做碱基识别。

二、 MinION相对于其他NGS测序平台的优势

1、碱基修饰的检测

纳米孔测序技术可以检测四种胞嘧啶（cytosine）碱基修饰，分别为5-methycytosine，5-hydroxymethycytosine，5-formylcytosine和5-carboxylcytosine。检测准确率为92%-98%。

2、实时测序监控

对于临床实践，实时获取和分析DNA/RNA序列是一件很重要的事情。对于传统的NGS测序，做到这一点非常不易。但对于MinION，实现起来相对容易。这不仅是因为MinION体积小，易操作等，更是因为在测序过程中单分子穿过纳米孔，其电流变化可以检测并识别，这种设计允许用户在测序过程中根据实时结果做出一些判断。

实时测序监控对于MinION针对特定目标序列测序有重要的应用（图2）：当DNA片段通过纳米孔时，如果电流变化呈现与目标序列一样的趋势，则通过纳米孔。如果DNA片段与目标序列呈现不同的电流变化趋势，则不能通过纳米孔。通过这样的方式，实现目标序列的富集，从而显著减少测序时间，对于在野外和即时诊疗有重要意义。

3、测得更长的read

用MinION测序仪，对于1D read可以获得300kb长的read；对于2D read可以获得60kb长的read。利用MinION测序仪产生的长read，研究人员设法填充了人参考基因组Xq24号染色体一个长50kb的gap。该区域存在多个CT47基因串联拷贝，研究人员利用MinION的长read判断该区域极有可能存在8个CT47基因拷贝（图3）。

4、结构变异的检测

NGS短序列的特征使结构变异的检测往往不准确。这个问题在癌症的检测中尤其严重，这是因为癌症组织中充斥各种结构变异。研究人员发现利用MinION测得的几百个拷贝的长read得到的结构变异结果比NGS平台测得的上百万read得到的结果更可靠。

5、RNA表达分析

对于RNA表达分析，NGS平台测得的短序列带来的问题是序列需要进行拼接，才能得到转录本。这给可变剪切研究带来困扰。因为通常情况下NGS测序不能产生足够的信息将不同形式的可变剪切区分开来。而利用MinION测序仪产生的长read，可以更好地解决这个问题。研究人员利用果蝇的Dscam1基因为例，其存在18,612种可变剪切形式，利用MinION测序仪可以检测到超过7,000种可变剪切形式，而这样的结果利用NGS的短序列测序是不能够获得的。

6、生物信息学配套软件的发展

近些年来，随着生物信息分析方法的发展，MinION测序reads成功比对参考基因组的比例已经从66%提升至92%。文章下面对各种工具的适用场景进行了分别介绍。工具概述见表1。

1、碱基识别工具

Metrichor是ONT公司推出的基于隐马尔可夫模型进行碱基识别的软件。它的使用需要网络连接。MinION注册用户需要获得开发者账号才能获得软件的源代码。2016年初，两个实验室分别开发了Nanocall和DeepNano软件。这两个软件都可以在本地运行，不需要网络连接。Nanocall基于隐马尔可夫模型，可对1D read在本地进行碱基识别；DeepNano基于recurrent neural network fr amework，可以获得比隐马尔可夫模型更准确的碱基识别。

2、序列比对工具

传统的NGS序列比对软件不能满足MinION序列比对的需求。这是因为MinION测序数据错误率相对高且序列长，即使调整参数也不能取得好的效果。在这种情况下，适合MinION测序数据的比对软件应运而生。

MarginAlign是通过更好地估计MinION测序reads测序错误来源从而提高与参考基因组的比对效率。通过评估检测到的变异，发现其显著提高了比对的准确性。由于MarginAlign是基于LAST或BWA mem的比对结果进行优化，结果的最终准确性依赖最初的比对结果。

GraphMap是另一个用于MinION测序数据比对的软件。它利用的是一种启发式（heuristics）方法，对高错误率reads和长reads进行了优化。一项研究表明GraphMap比对的灵敏性可与BLAST媲美，且它对reads测序错误率的估计与MarginAlign相当。

3、从头组装工具

MinION测序数据不适合利用NGS数据组装的de Bruijn图法进行组装，主要存在两方面的原因。第一，de Bruijn图法等方法依赖测序reads拆分的k-mer测序准确，而高错误率的MinION测序reads不能保证这一点；第二，de Bruijn图的结构不适用长reads。

MinION测序数据的长reads更适合Sanger测序时期基于有overlap的共有（consensus）序列组装的方法。需要的是在组装前进行测序reads的纠错。第一个基于这种原理进行组装的研究组利用MinION数据组装了一个完整的E. coli K-12 MG1655基因组，序列准确率达到99.5%。他们利用的流程称为nanocorrect，首先利用graph- based，greedy partial order aligner方法进行纠错，然后利用Celera Assembler将纠错后的reads进行组装，最后利用nanopolish对组装结果进行进一步提升。

4、单核苷酸变异检测工具

Reference allele bias是一种在变异检测中倾向于少检测出变异的现象。该现象在测序reads错误率高的情况下尤为严重。

MarginAlign中的marginCaller模块是研究机构开发的适用于MinION测序数据的变异检测软件。MarginCaller利用maximum-likelihood参数估计和多条测序reads序列比对来检测单核苷酸变异。当计算机模拟出测序错误为1%时，测序深度在60X，marginCaller检测出的SNV具有97%的准确率和完整度。另外一项研究中，研究者利用GraphMap方法，检测人基因组的杂合变异，可以达到96%的准确率。利用计算机模拟的数据，GraphMap同样可以高准确率，高完整度地检测出结构变异。

Nanopolish也可以用来检测变异。它用的是event-level alignment算法。在该方法中，从参考基因组序列开始，依次评估参考基因组序列产生的电信号与测序reads的相似性进而依次修饰参考基因组序列，生成一个consensus read。直到consensus read与测序read产生的电信号足够相似，将consensus read与参考基因组序列比较，得到变异。该方法在埃博拉病毒的研究中有大约80%的准确性。

PoreSeq采用与Nanopolish类似的算法。它可以利用更低深度的测序数据获得高准确率和高完整度的SNV检测。在一项研究中，PoreSeq在16X测序深度下获得99%准确率和完整度的SNV检测，与marginAlign相比，它显著降低了测序深度。

5、共有序列的测序（consensus sequencing）方法

MinION测序数据目前只有92%的准确性。在低深度测序的情况下，不能够满足类似单体型（haplotype phasing）和人样品的SNV检测的要求。文章提到的解决问题的方法是rolling circle amplication，它的原理是将一个片段进行多次扩增，在一个DNA分子上生成多个拷贝，这样最终获得的共有序列测序结果的准确率可以达到97%。

三、MinION目前的应用领域

1、即时检测传染源

NGS测序方法可以在医院环境下进行传染源等病菌的检测，而MinION测序方法提供的是一种全新的体验。MinION在测序读长，携带的方便性，检测时长方面具有NGS不可比的优势。文献记载从样品准备到发现致病菌只需要6小时时间，而从样品放置机器到发现致病菌只需要4分钟。文章列举了截至目前用MinION测序仪涉及研究的物种及详细描述了西非爆发埃博拉病毒时，MinION测序方法在病毒检测过程中起到的重要作用。

2、非整倍体检测

MinION可以在胎儿非整倍体产前检测中发挥重要作用。利用NGS平台，通常需要1-3周时间获得结果。而利用MinION测序方法，文献报道只需要4小时。

3、太空应用

在太空飞行中，发掘细菌和病毒是很困难的事情。大部分研究是将样品带回地球进行测序鉴定。目前，NASA准备利用MinION测序仪在国际空间站进行病菌的实时测序。